SDx テザードメンブレンシステム

テザードメンブレンの構造 

テザードメンブレンは金電極の表面にリン脂質二重層を形成する人工膜で、一対の疎水性 ポリエチレングリコール (PEG) 鎖が有機ジスルフィドアンカーによって金表面に共有結合しています。PEG鎖の上部で結合した親油性のアルカンフィタニル基が、骨格として働き周辺の脂質膜をクラスター化させ、強いては連続膜を形成するまでになります。

PEG鎖のジスルフィドアンカーと同様、 フィタニル基 も膜を金表面に結合させるのでテザー 分子と呼ばれます。実際には金基質上でテザー同士はスペーサと呼ばれる親油性のフィタニル基 の無い類似の分子を介して離れています。これらのスペーサは膜の下にあり、直接膜には接していません。金基質表面はテザーとスペーサとで被覆されますが、 両者がくっつくことは無く、有機ジスルフィドアンカー基を挟んで離れています。

                                 図 1. テザードメンブレンシステムの構成

テザーとスペースとの平均間隔は4 nm (およそ水分子9個分)で、金表面上の膜の厚さは約2～4 nm （スペーサと金表面に作成されるテザ―チューンとのアングルに依る）、但し0.5 nmは有機ジスルフィドアンカが占めています。

従って膜と金表面間のスペースはPEG鎖、ジスルフィドアンカ群、様々なカチオンやアニオン、及び水分子の混合体で、これを総じてtethaPlasm™と呼ばれます。　これは生きた細胞の サイトプラズマ（細胞質）に相当し、サイトプラズマのようにバルク水とは若干異なる特性を示します。 余剰カチオンとアニオンを持つこのテザープラズマを'バイアスをかけた定電圧でチャージ' し、tethaPatch や tehaPod で測定します。

テザードメンブレンは丈夫です!

テザーとスペーサとの混合比は製造過程で異なります。標準のtethaPlate™ は膜の安定や柔軟性が最も高いとされる1:10の割合で提供されています。 高い柔軟性が求められる場合は 1:100 程度の割合まで使われますが、これ以下では膜の品質が損なわれ推奨できません。逆に100%まで上げると、安定性は最大限得られます。テザードメンブレンは電気パルスにも耐久性があり -500 ～ +800mV までアプライ可能で、従来のセルボルテージクランプ法に比べ高い電圧がかけられます。メンブレンは4℃で保存します。

tethaPlate™

tethaPlate™ は金電極（表面積 0.21 mm²、3.0 x 0.7 mm）を含む６つのチャンバーから成り、金電極表面はテザーとスペーサ分子とで被覆処理されています。適正なリン脂質ミクスチャーを加えると膜を自己形成します。ついで未処理の金カウンター電極を膜の上 0.15 mmにセットしますが、膜には接触させません。

tethaPlate は極めて頑丈なハウジングなので、通常のイオンチャネル標本が数日程度しか保存できないのに比べ、シンプルなリン脂質で調整したテザーﾄﾞ膜なら 4℃で数週間は安定して保存できます!

tethaPlate の使い方とテザードメンブレンの調整法は Training Videosをご覧ください。

膜タンパク

多くのタンパクは親油性部位と親水性部位から構成されており、こらがタンパクの三次構造（ tertiary protein structure）に関与しています。 親油性部位はかなりの頻度で細胞や細胞小器官、膜と結合していますので、これらのタンパクは膜タンパク（membrane proteins）と呼ばれます。

ある種の膜タンパクは、比較的透過性のある親油性の細胞膜を通るカチオンやアニオンのトランスポートを促進します。このようなタンパクをイオンチャネル (ion channels) と呼びます。

           図 2. イオンチャネルをテザードメンブレンにすケースした図
           タンパクの配位に留意、'superstructure' と呼ばれる巨大構造で一部がテザードプラズマの外へ突き出ています。

          

テザードメンブレンのテザー/スペース混合比で、取り込めるタンパクの大きさが決まります。標準的な1:10の混合比では40,000 Daまでのタンパクを取り込むのに適しているとされ、個々のタンパクはオリゴマーのポア構造に組み込まれて一部は最終的に膜内でイオンチャンネルを形成します。

グラミジン gramicidin　（1882Da) や バリノマイシン valinomycin （1111Da） など最も小さいイオンチャネルのポリペプチドでも、テザードメンブレンの中に均一に分布します。

図 2 に見られる様な大きなイオンチャネルは'superstructures' を呈し、メンブレンを突き抜け近傍の水性溶液まで延びています。中程サイズの'superstructures' でも密度の高いテザープラズマ内には納まりきらず、膜タンパクを押しのけ優先的に配位します（同様な現象は生体細胞では頻繁に起こっています）。

イオンチャネル

小さい分子量のイオンチャネルペプチド（グラジニン、バリノマイシン、マガイニン など）は純正品が市販されています。より大きなタンパクで市販されているものもありますが、多くはバクテリア培養や遺伝子技術（genomic) を利用したカスタムメイドで、生命工学研究室や企業から供給されています。

通常バクテリア培養では該当遺伝子を人工的にバクテリアに注入し、必要なイオンチャネルタンパクを発現させます。数日培養した後、バクテリアをハーベスタ処理してタンパク化合物を分離し精製（ゲル電気泳動などで）します。

これらは1990年代に開発された最先端技術で、プロテオミクス proteomics 研究室では盛んに利用されています。

ヒトのゲノムでは、約400種類のイオンチャネルがコード化されていると考えられていますが、まだその一部しか詳しく研究されていません。なかでも－ ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、塩素（などの陰イオン）－ は今日的な研究対象となっています。イオンチャネルは多様性が高いので、各組織内で様々な活性モードを担っています。

例えば神経細胞内では、様々なカリウムイオンチャネルがアクションポテンシャルの伝播、心拍リズム、圧変動に対する細胞の反応（機械刺激依存性イオンチャネル）に関与しています。

類似のイオンチャネルは別の器官でも生じますが、種によっては構造を変化させ最適な機能を確保しています。

イオノフォア

天然 ( ionomycin や calicimycin) 人工イオノフォア ionophores （クラウネーテル、calixeranes、cryptands) を問わずメンブレンシステムが利用できます。イオノフォアはポリペプチドだけではありません、極めて小さな分子でも部分的に脂肪親和性を有すればメンブレンに取り込めます。

従来のパッチクランプ法

従来のパッチクランプ法の実験では、マイクロピペット電極を使って細胞膜を捉え単一、または数個のイオンチャネルを記録します。通常、長時間試行錯誤しながら所定のポジションに電極を誘導します。標準的なイオンのカレントシグナルは極めて小さく （数ピコアンペア） 、良好なS/N比のシグナルを得るにはかなりの技能を要します。

                          

         Figure 3. 従来のパッチクランプ法 (http://en.wikipedia.org/wiki/Patch_clamp)

パッチクランプから派生したホールセルクランプやオーサイトクランプ法では、多くのイオンチャネルを連続的に記録できます。この場合はシグナルは大きいシグナル (かつ低ノイズ) で記録はできますが、様々なタイプのイオンチャネルを測定しますので解釈が複雑になるという難点もあります。

近年、オートパッチクランプ装置が開発され発売されていますが、技術的には従来の方法を踏襲したもので、再現性のあるシグナルを得るのに難点であったマイクロピペット電極のポジショニングの問題は完全には解決されてはいません。

ゲノム/プロテオーム革命 

上述のように、21世紀初頭にはゲノムやプロテオミクス技術の急激な進歩によって、イオンチャンネルタンパクの分離、定量分析が可能になりました。この技術は大学をはじめ様々な研究施設、製薬企業の研究室や病院の研究部門などに広まっています。

まず、精製したシングルタイプイオンチャネルの定量分析のルーティン化が可能になります。研究者にとって煩雑なイオンチャネルの細孔をパッチ記録する作業から開放されます。

tethaPatch™

人工テザードメンブレンのパッチ部位 (面積0.21 ㎜2) にシングルタイプのイオンチャネルタンパクをアッセンブリすることで、１～100万単位のチャネルを同時に測定します。

この方法では、パッチ内の全イオンチャネルの総イオン電流を測定することになり、マイクロアンペア単位のシグナルをい低いノイズレベルで測定できます。イオンチャネルは自発的にテザードメンブレン内に取り込まれ作用電極ともつながってますので、マイクロピペット電極を試行錯誤しながらパッチする作業から開放されます。

tethaPatch™ 技術はホールセルパッチクランプ法 （whole cell patch clamping) と似ていますが、従来法が測定に数時間要するのに比べて分単位で測定できます。 また、テザードメンブレンは丈夫なのでかなりの電圧パルスが導入できます。従来のパッチクランプではシールが "ブロー"するので容易ではありませんでした。従って従来法に比べ、電位依存性及び機械刺激依存性イオンチャネルを幅広いパルス振幅で測定できます。

ER466 ポテンショスタットデータシステム はtethaPatchのパルス設定やカレントシグナルの記録に便利です。

tethaPod™

tethaPod ではテザードメンブレンシステムを比較的大きいシグナルで扱うことができる利点があります。tethaPlate™ の電極に振幅の小さい(20 mV) ACシグナルを周波数を変えて掛けることで、膜のコンダクタンスとキャパシタンスが直接測定できます。これは医薬品の研究開発には重要な分析テーマで、膜のコンダクタンスを連続的にモニターし、しかもtethaPlate™では濃度の異なるイオンチャネルブロッカーやアクチュエータを添加し分析ができます。測定結果をドーズレスポンスとして解析し、新薬候補の迅速なスクリーニング法として利用することも可能です。

 

引用文献

_{商標権: tethaPod, tethaPatch, tethaPlate, and tethaPlasm は SDx Tethered Membranes Pty Ltd の商標です。}